Le mutazioni sono alla base dell’evoluzione, della biodiversità e del miglioramento genetico. Queste possono derivare naturalmente dalla riparazione di errori dovuti al processo di replicazione o da danni a carico del DNA. A partire dagli anni 30 del XX secolo, il “mutation breeding” ha impiegato l’esposizione a radiazioni ed il trattamento con agenti chimici per aumentare la frequenza di mutazioni utili. Quarant’anni più tardi, sono stati identificati gli enzimi di restrizione ed i meccanismi molecolari di difesa batterica sono stati elucidati. Ad oggi tra le più importanti classi di enzimi di restrizione ci sono le nucleasi sito-specifiche, come quelle basate 1) sulla struttura “a dita di zinco” (Zinc-Finger Nucleases, ZFN), 2) sulla struttura TALE (Transcription Activator-Like Effector Nucleases, TALEN) e 3) sul sistema CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas). A partire dal 1996 queste nucleasi sono state ingegnerizzate per modificare con altissima precisione il genoma degli organismi, dando l’avvio alla strategia del “genome editing”. Più nel dettaglio, le ZFN e le TALEN sono nucleasi sintetiche con domini che si legano al DNA e sono in grado di tagliarlo in punti specifici. Entrambe richiedono la creazione di una proteina personalizzata per ogni sequenza di DNA da tagliare: questo requisito rende tali tecniche più dispendiose in termini di tempo e risorse economiche rispetto alla creazione degli "RNA a guida singola" utilizzati nel sistema CRISPR/Cas. Infatti, quest’ultimo risulta più facile da sviluppare, poiché viene richiesta la generazione di una molecola di RNA e non di una proteina, che va a riconoscere e legare il locus bersaglio sul DNA. Gran parte del lavoro iniziale della nuova piattaforma CRISPR è stato fondato da due ricercatrici (Jennifer Doudna ed Emmanuelle Charpentier), e nel giro di pochissimi anni si è diffuso a macchia d’olio. Il CRISPR ha un potenziale elevatissimo e proprio per questo ha generato una vera “CRISPR revolution”, che spazia da applicazioni in ambito medico, farmacologico, biologico fino a quello agronomico. Le ricadute del CRISPR nel settore agricolo sono numerose e pongono questa piattaforma come la tecnologia più promettente per migliorare la sostenibilità ambientale, il mantenimento della biodiversità e la resistenza ai patogeni. Il “genome editing” permette di modificare o di introdurre un solo carattere favorevole e di mantenere inalterata la restante parte del genoma di una varietà. 

Obiettivi

Le nuove biotecnologie possono conseguire risultati importanti, ad esempio con l’introduzione di resistenze agli stress. I risultati disponibili dell’applicazione del CRISPR nel settore della resistenza ai patogeni includono ad oggi riso e frumento e sono inerenti la resistenza al batterio Xanthomonas oryzae, al Rice Tungro Spherical Virus (RTSV) e ai funghi Blumeria graminis e Magnaporthe oryzae. I bersagli genici dei patogeni sono ottimi candidati per lo sviluppo di varietà resistenti. In mais, lo studio della resistenza ai patogeni è focalizzato principalmente sul marciume della spiga causato da Fusarium verticillioides, un fungo endemico in tutte le coltivazioni di mais delle regioni temperate che causa perdite di produzione e accumulo di micotossine. L’approccio impiegato per incrementare la resistenza all’infezione fungina è basato sul “double CRISPR” in cui vengono individuati due siti da mutagenizzare per ogni gene bersaglio. I geni individuati sono coinvolti nelle vie di trasduzione del segnale e nella sintesi di metaboliti secondari coinvolti nel “cross-talk” pianta-patogeno. Il disegno molecolare adottato e la tecniche di trasformazione delle linee di mais sono cruciali per l’ottenimento di un processo di “editing” rapido da utilizzare nel miglioramento genetico e per lo studio delle interazioni pianta-patogeno.

Pubblicazioni

Borrelli V.M. G., Brambilla V., Rogowsky P., Marocco A., Lanubile A.  2018. The enhancement of plant disease resistance using CRISPR/Cas9 technology. Frontiers in Plant Science 1664-462X.

Doll, N.M., Laurine M. Gilles L. M., Gérentes M.F., Richard C., Just J., Fierlej Y., Borrelli V.M.G., Gendrot G., Ingram G.C., Rogowsky P., Widiez T. 2018. Single and multiple gene knockouts by CRISPR–Cas9 in maize. Plant Cell Reports, https://doi.org/10.1007/s00299-019-02378-1.